组成要素
主要由寡核苷酸(引物)、Taq DNA 聚合酶、dNTP、靶序列DNA 和PCR 反应缓冲液体系这五组成分组成。
① 引物
引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
② Taq DNA 聚合酶
目前有两种Taq DNA聚合酶供应, 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。
③ dNTP
dNTP,(脱氧核糖核苷三磷酸)的缩写。是包括dATP, dGTP, dTTP, dCTP,等在内的统称,N是指含氮碱基,代表变量指代A、T、G、C、U等中的一种。在生物DNA合成中,以及各种PCR(RT-PCR(reverse transcription PCR)、Real-time PCR)中起原料作用。
④ 靶序列DNA
模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。
RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。
⑤ 反应缓冲液
缓冲液以Mg2+为主要成分,Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为1.5~2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。