焦磷酸测序(Pyrosequencing)

一、焦磷酸测序(pyrosequencing)介绍

焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。焦磷酸测序法适于对已知的短序列的测序分析,其可重复性和精确性能与SangerDNA测序法相媲美,而速度却大大的提高。焦磷酸测序能够提供定量的实时数据,并且无需凝胶、探针或标记物。在对单核苷酸多态性(SNP),插入和缺失(indel)及未知的序列变异进行鉴定时,该技术还能对等位基因频率及CpG与非CpG(CpN)位点的DNA甲基化水平进行灵敏的定量检测。

二、技术原理:

第一步——测序引物和PCR扩增的、单链的DNA模板杂交,与酶—DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)、三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)—和底物—adenosine 5′ phosphosulfate (APS)、荧光素(luciferin)孵育。

第二步——四种dNTP(dATPS,dTTP,dCTP,dGTP)之一被加入反应体系,如与模扳配对(A—T,C—G),此dNTP与引物的末端形成共价键,dNTP的焦磷酸基团(PPi)释放出来。

注意:反应时deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (dATPS)是dATP的替代物,因为DNA聚合酶对dATPS的催化效率比对dATP的催化效率高,且dATPS不是荧光素酶的底物。

第三步——ATP硫酸化酶在APS存在的情况下催化焦磷酸形成ATP,ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素(oxyluciferin)的转化,氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号。

ATP sulfurylase

PPi+APS —————————> ATP

Luciferase,ATP

Luciferin —————————> oxyluciferin

第四步——ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解,淬灭光信号,并再生反应体系。

第五步——然后加入下一种dNTP。

在以上步骤循环进行中,互补DNA链合成,序列从pyrogram™的信号峰中决定。

利用PSQ96系统进行测序分析可期望得到20-30个碱基的读序长度,但是和任何测序技术一样,最大读序长度取决于模板的二级结构、碱基组成、PCR产物质量和其他参数。

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