收集到生物材料标本后,最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存,则应以液氮将生物材料迅速冷冻后,储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时,将储存于冷冻柜的材料取出,立即以加入液氮研磨成粉沫,不可以先行解冻,以避免RNase的作用。
一、从组织中提取总RNA
1、液氮研磨,组织块直接放入研钵中,加入少量液氮,迅速研磨,再加少量液氮,再研磨,如此三次,可组织研磨成粉沫状,按50-100mg组织/ml Trizol 加入Trizol试剂,并转入离心管准备下步操作。
2、匀浆:组织样品按50-100mg/mlTrizol 加入Trizol。另外,组织体积不能超过Trizol体积的10%,否则匀浆效果会不好,用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。
二、从细胞中提取总RNA
1、培养贴壁细胞:不须消化,可直接用Trizol进行消化、裂解,Trizol体积按10cm2/ml比例加入。
2、悬浮细胞可直接收集、裂解,每1ml Trizol可裂解5×106动物、植物或酵母细胞,或107 细菌细胞。
三、从血液中提取总RNA
1、淋巴细胞提取:取新鲜全2 ml 加1 ml 3 %柠檬酸钠,混匀后3000 r/min 离心, 10 min , 4 ℃,取血球层上浅黄色层即为淋巴细胞.
2、取1个离心管(经DEPC 水处理) 加入淋巴细胞液150μl . 然后加1mlTRIZOL
四、从昆虫、植物中提取总RNA
1、称取0.1g新鲜的样品放入用液氮预冷的研钵中,边加液氮边研磨至细粉状(对于体壁较硬的组织可加入石英砂一起研磨)。
2、迅速用药匙取研磨好的细粉加入到含1ml TRizol的离心管中(以50-100mg组织加入1ml Trizol液),注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的 10%)。
3、立即用振荡器振荡2min使之快速溶解于裂解液之中。
4、室温10min 期间不断振荡,让组织充分裂解。
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