主要试剂配方
2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml,先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌, 冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇 (400ul) 氯仿-异戊醇(24:1):先加96ml氯仿,再加4ml异戊醇,摇匀即可。
实验步骤
1. DNA的提取
1、2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。
2、取少量叶片(约1g)置于研钵中,用液氮磨至粉状;
3、加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液,轻轻搅动;
4、将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌离心管中,磨碎液的高度约占管的三分之二;
5、置于65℃的水浴槽或恒温箱中,每隔10 min轻轻摇动,40 min后取出;
6、冷却2 min后,加入氯仿-异戊醇(24:1)至满管,剧烈振荡2~3 min,使两者混合均匀;
7、放入离心机中10 000 rpm离心10 min,与此同时,将600 µl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中;
8、10 000 rpm离心1 min后,移液器轻轻地吸取上清夜,转入含有异丙醇的离心管内,将离心管慢慢上下摇动30 sec,使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物;
9、10000 rpm离心1 min后,立即倒掉液体,注意勿将白色DNA沉淀倒出,将离心管倒立于铺开的纸巾上; (10)60 sec后,直立离心管,加入720 µl的75%乙醇及80 µl 5 M的醋酸钠,轻轻转动,用手指弹管尖,使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中;
11、放置30 min,使DNA块状物的不纯物溶解;
12、10000 rpm离心1 min后,倒掉液体,再加入800 µl 75%的乙醇,将DNA再洗 30 min;
13、10000 rpm离心30 sec后,立即倒掉液体,将离心管倒立于铺开的纸巾上;数分钟后,直立离心管,干燥DNA(自然风干或用风筒吹干);
14、加入50 µl 0.5 × TE(含RNase)缓冲液,使DNA溶解,置于37℃恒温箱约15 h,使RNA消解;
15、琼脂糖电泳检测,置于-20℃保存、备用。
注意事项
1、叶片磨得越细越好。
2、由于植物细胞中含有大量的DNA酶,因此,除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外,第一步的操作应迅速,以免组织解冻,导致细胞裂解,释放出DNA酶,使DNA降解。
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