出汗有两种方式：主动出汗和被动出汗。

因为天气、环境或心理压力造成的出汗称为被动出汗，如下班等公交车时，被太阳晒得衣服都湿透了；被工作压力所困扰，烦躁焦虑，急得额头微微渗出汗珠；和朋友一起蒸桑拿，在闷热的环境中汗如雨下……

只有因运动而产生的排汗才是主动出汗。

调查显示，不管在城市还是农村，能经常运动的人，比例只占到28.2%。这说明，现代人的主要出汗方式都是被动出汗。

主动出汗的8大养生保健作用

1、排出毒素。
首都医科大学附属北京朝阳医院副院长沈雁英教授表示，主动出汗能加快人体的体液循环和代谢过程，将体内堆积的乳酸、尿素、氨等毒素排出，还能保障鼻子、皮肤、肺脏、大肠这一系统畅通。

2、控制血压。
高血压是一种由于血管内径变窄、变硬，单位血流量受到限制而出现的一种现象，运动出汗可以扩张毛细血管，加速血液循环，增加血管壁弹性，达到降低血压的目的。

3、促进消化。
不出汗、气血运行慢了会影响消化，导致人吃不香；神经活动也会因此受到影响，导致人晚上睡不香。

4、防骨质疏松。
不少人以为出汗会导致体内钙质随汗液流失，对此，卫生部北京医院药学部临床药师张亚同指出，只有水溶性的维生素才会随汗液流失，钙虽然溶于水，但溶解度很低，不太会随着汗液排出。相反，出动汗有利于钙质的有效保留，防止骨质疏松。

5、增强记忆。
美国针对2万中学生进行的一项长期教育实验表明，主动运动流汗对学生会产生积极正面的效果，记忆力、专注力都能得到大幅度提升。

6、护肤美容。
总不出汗的人，皮肤代谢缓慢，一些废弃物难以排出。出汗可以清洁毛孔，达到美容护肤的功效。

7、减肥。
当人体运动并达到一定强度时，脂肪便会燃烧转化成热量，通过汗液排出体外。

8、让男人更有魅力。
美国宾夕法尼亚州立大学的研究人员表示，男性流汗的气味能使女性心情愉快并感到精神放松。

　　一、从组织中提取总RNA

　　1、液氮研磨，组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，再加少量液氮，再研磨，如此三次，可组织研磨成粉沫状，按50-100mg组织/ml Trizol 加入Trizol试剂，并转入离心管准备下步操作。
　　2、匀浆：组织样品按50-100mg/mlTrizol 加入Trizol。另外，组织体积不能超过Trizol体积的10%，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。

　　二、从细胞中提取总RNA

　　1、培养贴壁细胞：不须消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按10cm2/ml比例加入。
　　2、悬浮细胞可直接收集、裂解，每1ml Trizol可裂解5×106动物、植物或酵母细胞，或107 细菌细胞。

　　三、从血液中提取总RNA

　　1、淋巴细胞提取：取新鲜全2 ml 加1 ml 3 %柠檬酸钠,混匀后3000 r/min 离心, 10 min , 4 ℃,取血球层上浅黄色层即为淋巴细胞.
　　2、取1个离心管(经DEPC 水处理) 加入淋巴细胞液150μl . 然后加1mlTRIZOL
　　四、从昆虫、植物中提取总RNA
　　1、称取0.1g新鲜的样品放入用液氮预冷的研钵中，边加液氮边研磨至细粉状（对于体壁较硬的组织可加入石英砂一起研磨）。
　　2、迅速用药匙取研磨好的细粉加入到含1ml TRizol的离心管中（以50-100mg组织加入1ml Trizol液），注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的 10%）。
　　3、立即用振荡器振荡2min使之快速溶解于裂解液之中。
　　4、室温10min 期间不断振荡，让组织充分裂解。

2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌, 冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇 （400ul） 氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。

实验步骤

1. DNA的提取
　　1、2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。
　　2、取少量叶片（约1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状；
　　3、加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；
　　4、将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二；
　　5、置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出；
　　6、冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管，剧烈振荡2~3 min，使两者混合均匀；
　　7、放入离心机中10 000 rpm离心10 min，与此同时，将600 µl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；
　　8、10 000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；
　　9、10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上； （10）60 sec后，直立离心管，加入720 µl的75%乙醇及80 µl 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；
　　11、放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解；
　　12、10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加入800 µl 75%的乙醇，将DNA再洗 30 min；
　　13、10000 rpm离心30 sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；
　　14、加入50 µl 0.5 × TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15 h，使RNA消解；
　　15、琼脂糖电泳检测，置于-20℃保存、备用。

注意事项
　　1、叶片磨得越细越好。
　　２、由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。

　　1、接种细胞：收集对数期实验细胞，调整细胞悬液浓度（1×104~11×105个/ml），每孔接种100ul细胞悬液（每孔细胞数量103~104个/孔）。通常只选择中间60孔用作实验，边缘孔用无菌PBS填充（当然也可以用细胞培养基，只是有点浪费）。

　　2、加药处理：5%CO2，37℃孵育至细胞贴壁后即可加药，通常我们选择在前一天下午种96孔板，次日上午加药处理细胞。一般设5-7个药物梯度（用完全培养基配置2×稀释液），每孔100ul药物稀释液；每个梯度（组）设3-5个复孔，建议设5个。

　　3、5%CO2，37℃细胞培养箱孵育16-48小时（按实验需要选择）。

　　4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续37℃细胞培养箱孵育4h（若药物与MTT能够反应，可先弃去孔内培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液）。

　　5、终止培养，小心吸去孔内培养液（通常我们选择一次性甩去孔内培养液）。

　　6、每孔加入150ul二甲基亚砜，振荡２min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪检测OD492nm/570nm各孔的吸光度值。

　　7、特别说明：实验应同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）

　　悬浮细胞MTT实验操作：

　　悬浮细胞MTT实验操作与贴壁细胞基本相同，只是第5步终止培养，去孔内培养液是应先用酶标板离心机4000rpm离心5~10min（如果没有也可以想其他替代办法）。

　　一、直接标记抗体（FITC标记一抗）

　　1、收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。
　　2、用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。
　　3、用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。
　　4、用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。

　　二、间接免疫荧光标记法（普通一抗）

　　1、收集2×106个细胞，用冷的PBS 2ml 洗涤细胞一次，800rpm离心5min。
　　2、用2ml 4%多聚甲醛室温固定细胞40min,800rpm离心5min；2ml PBS重悬细胞，800rpm离心5min；
　　3、用1ml含0.2%Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10min,800rpm离心5min。
　　4、加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40min,800rpm离心5min，用2ml冷的PBS 重悬细胞，800rpm离心5min，洗去未结合一抗，重复一次。
　　5、加入荧光标记（FITC）标记的二抗，冰上避光放置40min后，800rpm离心5min，去上清，PBS洗涤两次。
　　6、加入0.5ml 1%多聚甲醛重悬细胞；固定待测。
　　7、流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。

　　三、细胞周期、细胞凋亡及DNA倍体分析样品（PI染色）的制备

　　1、待测样本制成单细胞悬液，然后2000转/分离心5分钟，弃上清。
　　2、用4℃预冷的70%冷乙醇固定，4℃保存，至少固定18小时。
　　3、调整细胞浓度为106细胞/毫升，取1毫升细胞悬液，用PBS洗三次，细胞重悬于1毫升PI染液中，37℃孵育30分钟即可进行流式分析。（备注：PI染液终浓度为50微克/毫升，RNase A终浓度为20微克/毫升）

　　1.标记蛋白质氨基的活化生物素：N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）。
　　2.标记蛋白质醛基的活化生物素：酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BCHZ）。
　　3.标记蛋白质巯基的活化生物素：3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）。
　　4.标记蛋白质核酸的活化生物素：常用于标记核酸分子的活化生物素有光生物素、生物素脱氧核苷三磷酸、BNHS和BHZ。

　　二、生物素标记的常识问题

　　1、活化生物素通过侧链与蛋白分子连接；
　　2、一个蛋白分子可被多个生物素标记－多价性；
　　3、对BNHS多标记抗体, BHZ则多标记微酸性抗原；抗原、抗体标记后活性不变；
　　4、可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记后活性将降低；

　　三、生物素标记蛋白质

　　生物素化蛋白质衍生物的特性生物素化蛋白质衍生物有两类：一种是生物素化的大分子生物活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标记物。

　　标记注意事项：

　　1、依抗原或抗体分子所带可标记基团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性，选择相应的活化生物素和反应条件；
　　2、标记反应时，活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例；生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1, IgG应用浓度
0.5~5μg/ml; 生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab；
　　3、为减少空间位阻影响，可在生物素与被标记物之间加入交联臂样结构；
　　4、生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性；标记酶时则结果有不同。

　　基本步骤：（平板克隆形成试验）

　　1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。

　　2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。

　　3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

　　4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。

　　克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）×100%

　　平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

　　因为MOI与细胞、细胞代数、细胞状态等都有关系，所以，一般做正式实验前都需要安排预实验，以了解细胞所需MOI以及病毒对细胞状态和传代的影响。

　　1、实验前保证细胞的良好生长状态，实验前一天接种3~5×103个目的细胞于96孔培养板中，所加培养基体积为90 µL，一次实验需要20个孔。分盘时，一般不用边上的孔。因为Lentivirus表达时间较慢，所以一般在三到四天后观察荧光，故在进行感染实验时细胞接种不宜过密（细胞的融合率约为30～50 %左右）。

　　2、感染预实验共分为两组不同感染条件，每组均有三个不同梯度的MOI。第一组为正常培养基中直接加病毒感染，也就是说在完全培养基中直接加入病毒；第二组加病毒同时在培养基中添加5ug/mL的polybrene。

　　3、实验开始，准备2个无菌的1.5 mL Ep管，在每个管中加入45 µL的常觃培养基，吸取5 µL的1×108TU/mL的病毒(预先从-80℃取出在冰上融化)加入到第一个管中，轻柔混匀，勿使产生泡沫。同样从第一管中吸取5 µL的病毒到第二个管中，混匀。于是第一个管中的病毒滴度为1×107 TU/mL，而第二个管中的滴度为1×106 TU/mL。如果病毒原液的滴度并不是1×108 TU/mL，则取一部分可以加常规培养基稀释使这成为1×108 TU/mL，将剩余分装冻回。

　　4、另取一个Ep管，取2 µL Polybrene稀释到400 µL。使用时在设置了添加Polybrene的孔中加入稀释后的Polybrene 10 µL，由于最后的体积为100 µL，所以Polybrene相当于被稀释了2000倍，最后的浓度为5 µg/mL。

　　5、先将10 µL三个不同梯度的病毒加到各组的相应孔中。加入的病毒量分别为1×106 TU，1×105 TU，1×104 TU，而细胞经过生长，此时细胞的数目大约为1×104个，所以三个孔的MOI分别为100、10、1。

　　6、在设定需要添加Polybrene的孔中加入10 µL的Polybrene稀释液。

　　7、在水平方向轻轻拍打培养板，使培养基和病毒等试剂充分混匀，然后把细胞板放回培养箱孵育。

　　8、培养8~12 h以后观察细胞状态，弃去细胞上清，更换为新鲜培养基。

　　9、感染3~4天后，观察荧光表达情况。对于生长缓慢代谢慢的细胞，可以适当延长观察时间，中途可以换液，保持细胞的活性。

　　10、通过细胞感染效果，确认目的细胞的感染条件和感染参数。

TAE缓冲液成分及终浓度：

　　1、2mol/L Tris碱
　　2、1mol/L 乙酸
　　3、100 mmol/L EDTA
　　4、水

配制1L的50×TAE缓冲液各成分用量：

　　1、 Tris碱（242g）
　　2、冰乙酸（57.1 ml）
　　3、EDTA【200ml的0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）】
　　4、水（补足1L）

50×TAE缓冲液的配制方法：

　　称下列试剂，1L烧杯
　　Tris                             242g
　　Na2EDTA.2H2O    37.2g
　　然后加入800ml的去离子水，充分搅拌溶解。
　　加入57.1ml的醋酸，充分混匀。
　　加去离子水定容至1L，室温保存。